Điều quan trọng trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn là tránh không đưa thêm vi khuẩn ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy. Do vậy, ngoài các thao tác luôn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng tuyệt đối, mọi yếu tố từ môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấy đến các vật dụng cần thiết đều phải được khử trùng trước khi sử dụng.
Phương pháp phân lập, nuôi cấy vi khuẩn là gì?
Phân lập là khâu quan trọng trong quá trình nghiên cứu nuôi cấy vi khuẩn.
Mục đích của phương pháp phân lập là tách riêng các vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo thành các clon thuần khiết để khảo sát và định loại. Khi vi khuẩn tăng trưởng và phát triển trên bề mặt môi trường rắn đã tạo ra những khuẩn lạc, hình thái của các khuẩn lạc sẽ mang tính đặc trưng của từng loại vi khuẩn. Việc mô tả chính xác các khuẩn lạc đã tách rời có thể góp phần rất quan trọng trong việc chẩn đoán vi khuẩn học. Các nhà nghiên cứu vi khuẩn học đã tiêu chuẩn hoá có ý nghĩa khi miêu tả hình dáng, độ cao và bờ, rìa của khuẩn lạc.
Điều quan trọng cách nuôi vi khuẩn là tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy. Do vậy, ngoài các thao tác luôn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng tuyệt đối, mọi yếu tố từ môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấy đến các vật dụng cần thiết đều phải được khử trùng trước khi sử dụng.
Điều quan trọng cách nuôi vi khuẩn là tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy
Các dạng mẫu cho nuôi cấy và dụng cụ cấy
Dạng mẫu nuôi cấy
Dạng dịch mẫu chỉ định nuôi cấy vi khuẩn đã được đồng nhất, dịch nuôi cấy hoặc môi trường lỏng chứa chủng vi sinh vật cần phân tích.
Dạng trên bề mặt của môi trường rắn chứa thạch (từ 1,5-2%) trong ống thạch nghiêng hay trong đĩa petri.
Dạng mẫu nằm sâu trong môi trường rắn trong ống nghiệm thạch sâu chứa thạch mềm (0,5-0,7%).
Dụng cụ cấy
Que cấy thẳng: Que cấy kim loại có đầu nhọn, dùng để cấy vi khuẩn có tạo khuẩn ty.
Que cấy móc: Đây là que cấy có đầu vuông góc, dùng để cấy vi khuẩn có tạo khuẩn ty.
Que cấy vòng: Là que cấy kim loại đầu có vòng tròn, dùng cấy chủng từ môi trường rắn hoặc lỏng lên môi trường rắn, lỏng.
Que cấy trang: Là que bằng kim loại hay thủy tinh, đầu hình tam giác, dùng để dàn trải vi khuẩn trên bề mặt thạch rắn.
Ống hút thủy tinh: Dùng để chuyển một lượng vi khuẩn cần thiết lên bề mặt môi trường rắn hoặc vào môi trường lỏng.
Đầu tăm bông vô trùng: Dùng để cấy giống từ môi trường lỏng lên bề mặt của môi trường rắn.
Có những phương pháp phân lập, nuôi cấy vi khuẩn nào?
Kỹ thuật cấy ria trên đĩa petri
Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng nhúng vào dịch mẫu để có các vi khuẩn muốn phân lập.
Ria các đường trên đĩa petri có chứa môi trường thạch thích hợp. Sau mỗi đường ria liên tục, hãy đốt khử trùng que cấy và làm nguội trước khi thực hiện thao tác tiếp theo.
Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp trong tủ ấm.
Kỹ thuật cấy trang
Dùng pipet chuyển 0,1ml dịch canh khuẩn lên trên bề mặt môi trường thạch trong đĩa petri.
Nhúng đầu thanh gạt vào cồn và hơ qua ngọn lửa để khử trùng. Sau đó, để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.
Mở đĩa petri, nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu thanh gạt trải đều dịch vi khuẩn lên trên bề mặt thạch. Quá trình thực hiện hãy xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng nửa chu vi đĩa để tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch vi khuẩn đều khắp bề mặt môi trường.
Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp trong tủ ổn nhiệt.
Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa môi trường lỏng
Đốt nóng đỏ đầu que cấy trong ngọn lửa rồi hơ nhẹ phần cán, rồi cầm thẳng đứng que cấy cho que cấy nóng đều.
Tay trái cầm ống nghiệm xoay nhẹ, tay phải cầm que cấy. Dùng ngón út của tay phải để mở nút bông. Sau khi mở nút bông, xoay miệng ống nghiệm qua ngọn lửa.
Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm và làm nguội que cấy (áp đầu que cấy vào thành ống cho nguội). Nhúng que cấy vào môi trường lỏng, rút thẳng que cấy ra không để dính vào thành và miệng ống để thu sinh khối. Hơ nóng miệng ống nghiệm và đậy nút bông rồi đặt ống nghiệm vào giá đỡ.
Đầu que nuôi cấy vi khuẩn được giữ ở vùng không khí vô trùng gần ngọn đèn. Dùng tay trái lấy ống nghiệm chứa môi trường mới rồi mở nút bông và khử trùng miệng ống nghiệm. Tiếp đó, đưa đầu que cấy vào bên trong môi trường.
Nhúng và khuấy nhẹ nhàng que cấy trong dịch môi trường để tách sinh khối ra khỏi đầu que cấy.
Rút thẳng đầu que cấy ra. Khử trùng miệng ống nghiệm và đậy nút bông.
Khử trùng que cấy ngay sau khi cấy xong.
Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống thạch nghiêng
Phương pháp này tiến hành tương tự như trên, nhưng có một số khác biệt sau:
Cấy giống lên trên bề mặt thạch nghiêng bằng cách đặt nhẹ đầu que cấy lên bề mặt môi trường ở đáy ống.
Sau đó, cấy theo hình chữ chi từ đáy ống nghiệm lên đến đầu trên mặt thạch nghiêng.
Cấy giống từ môi trường lỏng bằng pipet đầu rời
Pipet đầu rời cho phép thao tác chính xác với những dung tích nhỏ. Trong thao tác vô trùng, pipet đầu rời rất hữu dụng vì nó cho phép cấy chuyển dễ dàng dịch vi khuẩn lên bề mặt môi trường rắn trong đĩa petri để tạo khuẩn lạc rời hoặc vào ống nghiệm hoặc bình chứa môi trường lỏng để nuôi tăng sinh. Trước khi sử dụng, kiểm nghiệm viên cần biết các yêu cầu cơ bản trong cách nuôi vi khuẩn với pipet đầu rời như sau:
Pipet đầu rời cho phép thao tác chính xác với những dung tích nhỏ
Mỗi pipet đầu rời đều có giới hạn dung tích thao tác cho phép nhất định đó là: 0,1 ml, 1- 20ml, 20- 20ml, 0,2- 1 ml, 1-5 ml, 1- 10 ml. Nên chọn pipet đầu rời với giới hạn dung tích thích hợp cho phạm vi thao tác.
Pipet đầu rời có hai nấc: Nấc 1 tương đương với dung tích được chọn sử dụng khi hút dung dịch; nấc 2 (vượt quá nấc 1) dùng để bơm dung dịch ra khỏi đầu tip của pipet đầu rời.
Khi sử dụng pipet đầu rời để cấy chuyển dịch giống thì cần phải tiến hành trong không gian vô trùng của ngọn lửa trong tủ cấy.
Tay phải cầm pipet đầu rời, tay trái mở hộp chứa đầu tip vô trùng. Sau đó, cắm đầu pipet vào đầu tip.
Dùng tay trái giữ ống nghiệm và bình chứa dịch giống vi sinh vật. Dùng ngón út, áp út của tay phải đang giữ pipet để kẹp giữ và mở nút bông, sau đó hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm hoặc bình chứa.
Đưa đầu tip vô trùng vào bên trong dịch giống rồi hút lấy dung tích cần thiết. Sau đó, rút đầu tip ra khỏi miệng bình chứa, khử trùng miệng bình chứa và đậy bằng nút bông đang được giữ ở ngón út và áp út tay phải.
Đầu tip có chứa vi sinh vật cần được giữ ở vùng không khí vô trùng gần ngọn đèn.
Dùng tay trái lấy ống nghiệm hoặc bình chứa môi trường mới, dùng ngón út và áp út kẹp và mở nút bông, khử trùng miệng bình chứa.
Đưa đầu tip vào bên trong môi trường rồi bơm dịch giống vào môi trường. Sau đó, rút đầu tip ra khỏi miệng bình chứa, khử trùng miệng bình và đậy nút bông.
Đầu pipet đầu rời và đầu tip được chế tạo bằng polymer cần phải khử trùng tuyệt đối đầu pipet và đầu tip bằng ngọn lửa.
Để đảm bảo sự phát triển của vi khuẩn, sau khi nuôi cấy vi khuẩn xong phải quan tâm đến các điều kiện môi trường nuôi vi khuẩn như: Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của mỗi loài vi khuẩn và duy trì ổn định nhiệt độ; độ ẩm trong quá trình nuôi ủ cần đảm bảo đủ lượng nước; khí oxy đối với vi sinh vật hiếu khí, lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải để oxy không khí có thể thấm vào.
Hiện nay chẩn đoán vi sinh là xét nghiệm không thể thiếu đối với các bệnh nhiễm trùng, trong đó kỹ thuật được phổ biến rộng rãi và dễ áp dụng ở các cơ sở y tế là kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn. Tùy từng loại bệnh phẩm, tác nhân gây bệnh để thực hiện các kỹ thuật nuôi cấy khác nhau. Bài viết dưới đây sẽ giúp các bạn hiểu thêm về ý nghĩa và các phương pháp nuôi cấy vi khuẩn.
1. Nuôi cấy vi khuẩn là gì?
Nuôi cấy vi khuẩn là phương pháp làm tăng số lượng vi khuẩn, làm cho vi khuẩn cần xác định tách riêng với quần thể vi khuẩn ban đầu bằng cách nuôi cấy chúng trên các môi trường chuyên biệt nhằm tạo ra những đặc trưng riêng của loại vi khuẩn đó. Nuôi cấy vi khuẩn là phương pháp quan trọng và cơ bản nhất để chẩn đoán chính xác căn nguyên gây bệnh.
Hình 1: Nuôi cấy vi khuẩn trên các môi trường thạch nuôi cấy chuyên dụng
- Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn điều quan trọng nhất là phải đảm bảo nguyên tắc vô trùng, tránh để tạp nhiễm các vi khuẩn khác từ bên ngoài không khí hay các dụng cụ, vật dụng từ bên ngoài bởi nó sẽ ảnh hưởng đến quá trình xác định căn nguyên chính gây bệnh.
2. Các phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
Tùy vào mục đích nuôi cấy và loại bệnh phẩm để tiến hành lựa chọn các phương pháp nuôi cấy khác nhau.
- Dụng cụ cần trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn gồm:
+ Đèn cồn, que cấy, pipet Pasteur.
+ Tủ ấm, tủ an toàn sinh học.
+ Ống nghiệm,…
- Môi trường nuôi cấy phù hợp, nước muối sinh lý 0.9%.
2.1. Phương pháp cấy phân vùng vi khuẩn
- Mục đích: Nhằm phân lập vi khuẩn gây bệnh thành khuẩn lạc riêng rẽ giúp chẩn đoán căn nguyên gây bệnh.
- Bệnh phẩm sử dụng phương pháp cấy phân vùng là: các loại dịch (dịch não tủy, dịch sinh dục,…), phân, mủ,…
- Một số môi trường cấy phân vùng là: Blood Agar (môi trường thạch máu), Chocolate Agar (môi trường thạch Socola), TCBS, Macconkey, SS,…
- Quy trình thực hiện:
+ Ghi đầy đủ thông tin bệnh phẩm, ngày nuôi cấy lên đĩa thạch.
+ Sử dụng que cấy vô trùng để lấy bệnh phẩm ra môi trường nuôi cấy và tiến hành cấy phân lập hoặc cấy định lượng tùy từng loại bệnh phẩm
+ Cấy vùng 1: Dùng que cấy có bệnh phẩm tạo một vùng nguyên ủy ở rìa đĩa thạch nuôi cấy sau đó ria đều vi khuẩn theo đường ziczac với diện tích chiếm 1/4 diện tích đĩa thạch.
+ Cấy vùng 2: xoay đĩa 90 độ, tiến hành cấy vùng 2 bằng cách di chuyển que cấy theo đường ziczac thưa hơn so với vùng 1 và vùng 2 cũng chiếm 1/4 đĩa.
+ Cấy vùng 3: xoay đĩa 90 độ và cấy tương tự như cấy vùng 2. Sao cho 2 - 3 đường cấy ở vùng 3 cũng phải chạm vào vùng 2 và đường cấy thưa hơn so với vùng 2. Diện tích cấy là 1/4 đĩa thạch tiếp theo.
+ Cấy vùng 4: xoay đĩa 90 độ và cấy tương tự như trên ở 1/4 đĩa cuối cùng.
+ Nếu dùng que cấy kim loại thì sau mỗi lần cấy ở 1 vùng khác đều phải đốt tiệt trùng que cấy, nếu dùng que cấy vô khuẩn 1 lần thì sau mỗi lần chuyển vùng cấy cần thay que khác. Sau khi cấy xong thì cần giữ môi trường nuôi cấy trong tủ ấm 37 độ C có thể có khí CO2 hoặc không (tùy từng loại môi trường). Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn sau 18 - 24h
- Lưu ý: các đường cấy ở vùng sau phải chạm vào đường cấy ở vùng trước để đảm bảo vi khuẩn mọc được ở tất cả các vùng và tạo khuẩn lạc riêng rẽ.
Hình 2: Nuôi cấy phân lập 4 vùng tạo khuẩn lạc riêng rẽ
2.2. Phương pháp cấy đếm vi khuẩn
- Mục đích: dùng để xác định số lượng vi khuẩn có khả năng phát triển trong 1 thể tích bệnh phẩm.
- Bệnh phẩm thường dùng trong phương pháp này là nước tiểu.
- Môi trường sử dụng cấy đếm: Thạch máu
- Quy trình:
Cấy đếm bằng que cấy có thể tích 1 microlit:
+ Sử dụng que cấy lấy đủ thể tích của bệnh phẩm, sau đó ria que cấy thẳng 1 đường chính giữa đĩa thạch để tạo đường nguyên ủy.
+ Dàn đều vi khuẩn khắp đĩa thạch theo đường ziczac và các đường cấy này đều phải đi qua đường nguyên ủy. Để đĩa thạch trong tủ ấm ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
Hình 3: Phương pháp cấy đếm
+ Để trong tủ ấm 37 độ C qua đêm.
Sau khi nuôi cấy môi trường cấy sẽ được theo dõi sự phát triển của vi khuẩn sau mỗi 24h, nếu thấy có xuất hiện vi khuẩn gây bệnh sẽ được tiến hành định danh bằng nhiều kỹ thuật khác nhau: định danh dựa trên tính chất sinh vật hóa học cơ bản, định danh bằng thanh API, định danh bằng máy tự động,... để tìm ra chủng vi sinh vật gây bệnh và sau đó làm kháng sinh đồ cho vi khuẩn đó
Nếu không thấy có sự xuất hiện của vi khuẩn gây bệnh sau 48 - 72h thì kết luận nuôi cấy âm tính
3. Tại sao nên khám chữa bệnh ở Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC?
Sức khỏe là thứ quý giá nhất đối với mỗi con người bởi có sức khỏe là có tất cả. Việc chăm sóc sức khỏe là việc quan trọng và cần thiết với mỗi người. Nhưng để chọn một nơi khám chữa bệnh đảm bảo chất lượng và uy tín thì không phải đơn giản. Hiện nay có rất nhiều cơ sở khám chữa bệnh nhưng lựa chọn Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC là sự đúng đắn hơn cả.
Hình 4: Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC - địa chỉ khám bệnh tin cậy uy tín
Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC với dịch vụ khám chữa bệnh uy tín, đã có thương hiệu tại Hà Nội và nhiều tỉnh thành trong cả nước. Bệnh viện đã có thời gian hoạt động trên 24 năm trong lĩnh vực y tế, đội ngũ bác sĩ có trình độ chuyên môn cao với nhiều năm kinh nghiệm trong nghề; hệ thống máy móc trang thiết bị hiện đại bậc nhất cả nước. Bên cạnh đó chi phí khám sức khỏe vô cùng hợp lý và có nhiều dịch vụ hỗ trợ bệnh nhân như: áp dụng thanh toán bảo hiểm y tế lên đến 100%, ngoài ra bệnh viện còn tiếp nhận bảo lãnh cho các khách hàng có thẻ bảo hiểm của gần 40 công ty, hãng bảo hiểm trên cả nước. Có thể kể đến một số công ty sau:
- Bảo hiểm Bảo Việt.
- Bảo hiểm dầu khí PVI.
- Công ty Insmart.
- Bảo hiểm Vietinbank (VBI).
- Bảo hiểm bưu điện PTI
- Bảo hiểm BIDV (BIC).
- Bảo hiểm Baoviet Tokio Marine.
- Bảo hiểm nhân thọ Dai-ichi Life.
Để được tư vấn và biết thêm thông tin chi tiết về các dịch vụ khám bệnh bạn có thể liên hệ với chúng tôi theo số 1900565656 hoặc truy cập vào website: medlatec.vn.