ĐẾM TẾ BÀO LYMPHO T-CD3, T-CD4, T-CD8 BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TẾ BÀO DÒNG CHẢY (Lympho T-CD3, -CD4, -CD8 enumeration by flow cytometry) ĐẾM TẾ BÀO LYMPHO T-CD3, T-CD4, T-CD8 BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TẾ BÀO DÒNG CHẢY (Lympho T-CD3, -CD4, -CD8 enumeration by flow cytometry) I. NGUYÊN LÝ CD3 là kháng nguyên lympho T chung. CD3 có trên bề mặt tất cả các tế bào lympho T. Kháng nguyên CD4 có trên bề mặt tế bào lympho T hỗ trợ, tế bào mono, và một số bạch cầu hạt hoạt hóa. Kháng nguyên CD8 có trên bề mặt các tế bào lympho T gây độc và lympho T ức chế. Do vậy, sử dụng kỹ thuật phân tích tế bào dòng chảy dùng các kháng thể đơn dòng kháng CD3, CD4, CD8 có gắn màu huỳnh quang khác nhau có thể đồng thời phát hiện và xác định chính xác các dấu ấn trên bề mặt các tế bào lympho cũng như có thể đếm được tỷ lệ phần trăm và số lượng tuyệt đối các tế bào lympho T-CD3, T-CD4, và T- CD8 trong mẫu bệnh phẩm. II. CHỈ ĐỊNH Các trường hợp cần đánh giá tình trạng miễn dịch tế bào, cần đếm CD3-4-8. III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH Không có chống chỉ định. IV. CHUẨN BỊ 1. Người thực hiện - Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật; - Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng. 2. Phương tiện - Hóa chất 2.1. Phương tiện - Máy phân tích tế bào dòng chảy (4 màu huỳnh quang trở lên); - Máy ly tâm ống máu; - Pipet và đầu pipet loại 25µl và 1000µl; - Ống nghiệm chuyên dụng cho phân tích trên máy đếm tế bào dòng chảy; - Găng tay. 2.2. Hóa chất - Dung dịch đệm PBS; - Kháng thể đơn dòng kháng CD45-PC5, CD3-ECD, CD4-PE, CD8-FITC; - Hạt Flow count; - Dung dịch ly giải hồng cầu. - Nước cất, hóa chất khử trùng Natri hypoClorite, 3. Bệnh phẩm Là mẫu máu ngoại vi của người bệnh. 4. Người bệnh Thông báo trước khi thực hiện xét nghiệm. 5. Phiếu xét nghiệm Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về người bệnh: họ tên, tuổi, gường bệnh, khoa phòng, chẩn đoán… V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH 1. Lấy bệnh phẩm - Lấy 2 ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA. 2. Tiến hành kỹ thuật - Lấy 100 µl máu ngoại vi chống đông cho vào 1 ống phân tích tế bào dòng chảy đã ghi tên người bệnh. - Thêm 20 µl mỗi loại kháng thể CD45-PC5, CD3-ECD, CD4-PE, CD8-FITC. - Trộn đều, ủ nhiệt độ phòng trong 20 phút, tránh ánh sáng. - Thêm 2000 µl dung dịch ly giải hồng cầu, ủ nhiệt độ phòng trong 10 phút. - Ngay sau khi kết thúc bước ủ trên, thêm 100 µl huyền dịch hạt tham chiếu, trộn đều và đem phân tích trên máy phân tích tế bào dòng chảy. - Phân tích bằng chương trình đếm T-CD3_T-CD4_T-CD8 có sẵn trên máy phân tích tế bào dòng chảy (lưu ý nhập liệu số lượng bạch cầu có trong mẫu và nồng độ hạt tham chiếu). VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ 1. Đọc kết quả Kết quả do chương trình máy tính tự động xuất ra dưới dạng số lượng tuyệt đối T-CD3, T-CD4, T-CD8 và tỷ lệ % T-CD3, T-CD4, T-CD8. 2. Nhận định kết quả - Lưu ý số lượng tuyệt đối và tỷ lệ T-CD4 được lấy từ quần thể tế bào lympho có CD3+CD4+, số lượng tuyệt đối và tỷ lệ T-CD8 được lấy từ quần thể tế bào lympho có CD3+CD8+. - Bình thường: T-CD3: 800-2300 tế bào/uL (55-80%) T-CD4: 400-1300 tế bào/uL (35-55%) T-CD8: 250-800 tế bào/uL (20-35%) VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ - Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy xét nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy. Xử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại các thông tin cần thiết, nếu mẫu bị đông hoặc đã để quá lâu thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm. - Các vùng tế bào lympho không nằm trong cửa sổ chương trình chạy. Nguyên nhân có thể do thực hiện không đúng, lượng kháng thể ủ không đủ, thực hiện không đủ các bước của quy trình, ủ không đủ thời gian, hút pipet không tốt, tắc kim hút trên máy… Xử trí: Làm lại xét nghiệm và tuân thủ theo đúng quy trình. Kiểm tra máy trước khi phân tích, phải rửa máy, đuổi bọt khí và thông kim hút (nếu cần) theo hướng dẫn đi theo máy. - Chỉ ra kết quả tỷ lệ % T-CD3, T-CD4, T-CD8 mà không có số lượng tuyệt đối T-CD3, T-CD4, T-CD8. Thường do quên không nhập thông số về số lượng bạch cầu trong mẫu và nồng độ hạt tham chiếu. Xử trí: Phân tích lại ống mẫu đã ủ. Lưu ý nhập thông số về số lượng bạch cầu trong mẫu và nồng độ hạt tham chiếu. |
